文獻(xiàn)解讀
廣西醫(yī)科大學(xué)的南阿若教授課題組在《Molecular Cancer 》上發(fā)表題為“o8G-modifed circPLCE1 inhibits lung cancer progression via chaperone-mediated autophagy” 的研究性論文。
該研究表明，o8G修飾的circPLCE1可通過分子伴侶介導(dǎo)的自噬調(diào)控巨自噬的發(fā)生，最終抑制肺癌的進(jìn)展。
研究方向：肺癌
據(jù)統(tǒng)計，肺癌在全球惡性腫瘤中的發(fā)病率和死亡率中均位居首位?，F(xiàn)有研究已證實多種編碼基因和非編碼RNA參與肺癌的發(fā)生發(fā)展，且針對特異性基因產(chǎn)物的藥物的開發(fā)極大地改善了肺癌患者的治療，但肺癌的預(yù)后仍然較差。因此，深入研究肺癌發(fā)生的分子機制，闡明其精確的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和信號通路至關(guān)重要。
環(huán)狀RNAs（circRNAs）
環(huán)狀RNAs（circRNAs）是一類由反向剪接產(chǎn)生的具有共價閉環(huán)的RNA，無5’cap和3’poly（A）尾結(jié)構(gòu)，可作為microRNA（miRNA）的海綿，或是直接與mRNAs、蛋白結(jié)合，在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。其中，circPLCE1在亞砷酸鈉誘導(dǎo)的惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化模型中表達(dá)失調(diào)，提示circPLCE1可能參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。因此，本文選擇circPLCE1作為研究對象，旨在系統(tǒng)闡明其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的分子調(diào)控機制及其潛在臨床應(yīng)用價值。
項目研究
亞砷酸鈉誘導(dǎo)人支氣管黏膜上皮細(xì)胞（BEAS-2B-As）惡性轉(zhuǎn)化模型的高通量測序結(jié)果表明，circPLCE1（hsa_circ_0019225）表達(dá)顯著下調(diào)。
RT-qPCR定量結(jié)果顯示，與BEAS-2B相比，非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299細(xì)胞中circPLCE1的表達(dá)下調(diào)更顯著。因此，選擇A549和H1299細(xì)胞用于后續(xù)體外研究。結(jié)合UCSC Genome Browser數(shù)據(jù)庫及Sanger測序結(jié)果，研究人員成功驗證其反向剪接位點。RNA穩(wěn)定性實驗顯示，circPLCE1的半衰期比同源線性mRNA更長，穩(wěn)定性更高，證實其具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
臨床樣本分析顯示，circPLCE1在肺癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織，且在II-IV期肺癌組織中的表達(dá)顯著低于I期肺癌組織，其表達(dá)水平與腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析顯示，circPLCE1低表達(dá)患者的總生存期比高表達(dá)患者更差。ROC分析揭示了circPLCE1作為肺癌預(yù)后生物標(biāo)志物的潛在價值。
圖1 circPLCE1在肺癌組織和細(xì)胞中顯著下調(diào)
隨著RNA修飾研究的深入，o8G修飾在調(diào)控RNA分子表達(dá)以及腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用已被揭示。
為了探究o8G修飾是否發(fā)生在circPLCE1上，作者使用o8G修飾特異性抗體進(jìn)行了甲基化RNA免疫共沉淀（MeRIP）實驗。結(jié)果顯示，circPLCE1在抗o8G抗體組中顯著富集，表明o8G修飾可以發(fā)生在circPLCE1上。紫外交聯(lián)免疫共沉淀（CLIP）實驗結(jié)果證實o8G修飾主要位于circPLCE1的第10個區(qū)域。
研究表明，o8G RNA氧化修飾是在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）攻擊mRNA中的鳥嘌呤從而產(chǎn)生的一種RNA修飾。鑒于梯度預(yù)實驗結(jié)果，最終選用200μM的H2O2和 2mM的NAC用于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)ROS水平探究。
IF實驗結(jié)果表明，H2O2增加了細(xì)胞內(nèi)o8G修飾水平，NAC處理則相反，表明o8G修飾水平與細(xì)胞內(nèi)ROS水平呈正相關(guān)。MeRIP實驗中，H2O2處理組的circPLCE1 o8G修飾水平增加，表明ROS可誘導(dǎo)circPLCE1的o8G修飾。
此外，RNA穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示，ROS誘導(dǎo)的o8G修飾導(dǎo)致circPLCE1的半衰期縮短，穩(wěn)定性降低。
已有研究表明，AUF1可作為‘reader’優(yōu)先識別RNA中的o8G修飾，從而影響RNA的穩(wěn)定性，RNA免疫共沉淀（RIP）實驗結(jié)果驗證，circPLCE1可以直接與AUF1結(jié)合，且隨著o8G修飾水平的增加，AUF1的富集程度也增加，表明AUF1特異性識別circPLCE1的o8G修飾。利用siRNA介導(dǎo)AUF1沉默后，o8G修飾導(dǎo)致circPLCE1的穩(wěn)定性下降被逆轉(zhuǎn)。
綜上，ROS增加了circPLCE1的o8G修飾水平，而AUF1可以作為o8G修飾的‘reader’，介導(dǎo)circPLCE1穩(wěn)定性和表達(dá)的下降。
圖2 circPLCE1的o8G修飾
隨后，作者進(jìn)行了一系列功能實驗，以探究circPLCE1在體外的生物學(xué)功能。
EdU細(xì)胞增殖實驗和CCK-8結(jié)果顯示，circPLCE1沉默可顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖，增加肺癌細(xì)胞的活力；過表達(dá)則反之。
流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明，circPLCE1沉默抑制細(xì)胞凋亡，并加速細(xì)胞周期進(jìn)程；過表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減緩細(xì)胞周期。
Transwell和傷口愈合實驗發(fā)現(xiàn)，circPLCE1能夠抑制肺癌細(xì)胞的遷移。綜上所述，circPLCE1在體外能夠顯著抑制肺癌的進(jìn)展。
圖3 circPLCE1在體外可顯著抑制肺癌的進(jìn)展
上述研究已闡明circPLCE1在體外具有顯著抑制肺癌進(jìn)展的生物學(xué)功能。為了進(jìn)一步探究其體內(nèi)的作用機制，作者建立了裸鼠皮下移植瘤模型。
實驗進(jìn)程
通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)circPLCE1的A549細(xì)胞系后，將該過表達(dá)細(xì)胞株和對照細(xì)胞株分別皮下注射至裸鼠右背部，每三天監(jiān)測裸鼠的生存狀態(tài)，并測量小鼠體重和腫瘤直徑。
與對照組相比，過表達(dá)circPLCE1組小鼠的腫瘤體積更小且生長速度更慢。在腫瘤形成21天后處死裸鼠，取出腫瘤進(jìn)行觀察和稱重。
與對照組相比，circPLCE1過表達(dá)組的腫瘤體積更小且重量更輕。隨后，通過免疫組化檢測裸鼠腫瘤中與肺癌進(jìn)展相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，包括增殖相關(guān)蛋白（Ki67）、凋亡相關(guān)蛋白（BCL2）和遷移相關(guān)蛋白（RhoA）。定量分析顯示，與對照組相比，穩(wěn)定過表達(dá)circPLCE1組的腫瘤中Ki67、BCL2和RhoA蛋白的表達(dá)均降低。這些結(jié)果表明，circPLCE1在體內(nèi)能夠顯著抑制肺癌的進(jìn)展。
圖4 circPLCE1在體內(nèi)可顯著抑制肺癌的進(jìn)展
由于基因的亞細(xì)胞定位與其分子機制密切相關(guān)，作者通過核質(zhì)分離和熒光原位雜交（FISH）實驗發(fā)現(xiàn)，circPLCE1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，但主要定位于細(xì)胞質(zhì)。
大量研究表明，circRNA通過與蛋白質(zhì)直接結(jié)合是其發(fā)揮功能的重要機制。因此，通過標(biāo)記RNA親和純化（TRAP）-質(zhì)譜（MS）技術(shù)富集并鑒定了與circPLCE1直接結(jié)合的蛋白質(zhì)，并結(jié)合KEGG富集分析算法，發(fā)現(xiàn)circPLCE1可能參與多種腫瘤相關(guān)通路，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工等。
通過M-versus-A圖（MA圖）分析，作者選擇了該通路中結(jié)合評分最高的HSC70進(jìn)行深入研究。RIP實驗進(jìn)一步證實，circPLCE1能夠直接與HSC70蛋白結(jié)合。
隨后的Western blot分析顯示，circPLCE1負(fù)調(diào)控HSC70蛋白的表達(dá)。對HSC70表達(dá)的免疫組化分析也表明，在穩(wěn)定過表達(dá)circPLCE1的裸鼠腫瘤中，HSC70的表達(dá)顯著降低。從裸鼠腫瘤中提取蛋白質(zhì)并進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示，穩(wěn)定過表達(dá)circPLCE1后，裸鼠腫瘤中的HSC70蛋白水平降低。TCGA數(shù)據(jù)庫分析表明，HSC70高表達(dá)患者的生存率較低。
為了進(jìn)一步探究circPLCE1如何調(diào)控HSC70，作者用CHX處理A549細(xì)胞以抑制蛋白質(zhì)合成，發(fā)現(xiàn)circPLCE1顯著縮短了HSC70的半衰期；而MG132處理后，circPLCE1無法調(diào)控HSC70的蛋白表達(dá)水平，表明circPLCE1通過泛素-蛋白酶體途徑調(diào)控HSC70的蛋白表達(dá)。結(jié)合后續(xù)的免疫共沉淀（Co-IP）實驗，可得出結(jié)論：circPLCE1能夠影響HSC70蛋白的泛素化水平，并調(diào)控其泛素介導(dǎo)的降解。
此外，為評估circPLCE1是否可通過o8G修飾的方式調(diào)控HSC70蛋白表達(dá)，研究人員利用H2O2處理A549細(xì)胞并同時敲低AUF1，Western blot分析顯示，H2O2處理增加了HSC70蛋白的表達(dá)，而AUF1敲低則逆轉(zhuǎn)了HSC70蛋白表達(dá)的上調(diào)趨勢。綜上，o8G修飾降低了circPLCE1的穩(wěn)定性，而circPLCE1通過直接結(jié)合降低了HSC70的穩(wěn)定性和表達(dá)水平。
圖5 circPLCE1靶向HSC70蛋白并調(diào)控其泛素化
HSC70不僅參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工，也是分子伴侶介導(dǎo)的自噬（CMA）的關(guān)鍵蛋白。由于circPLCE1調(diào)控HSC70的蛋白表達(dá)水平，作者推測circPLCE1可能通過HSC70調(diào)控CMA通路，并選定兩種已報道的CMA底物（PKM2和HK2）進(jìn)行后續(xù)研究。
Co-IP和IF結(jié)果表明，HSC70與PKM2相互作用且共定位。CMA可在饑餓和氧化應(yīng)激等條件下被激活。在A549和H1299細(xì)胞的血清饑餓處理組中，隨著處理時間的延長（特別是在16小時和24小時時間點），HK2和PKM2的蛋白表達(dá)下降。同樣，隨著CMA特異性激動劑（AR7）作用濃度的增加，HK2和PKM2的蛋白表達(dá)下降。上述結(jié)果表明，CMA底物的表達(dá)水平與CMA活性相關(guān)，CMA活性增加后，底物表達(dá)水平下降。
隨后，分別沉默或者過表達(dá)circPLCE1，發(fā)現(xiàn)circPLCE1可正向調(diào)控CMA底物蛋白（HK2和PKM2）的表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示，體內(nèi)也存在同樣的調(diào)控。在過表達(dá)circPLCE1的同時，用20 μM AR7處理A549細(xì)胞24小時，Western blotting結(jié)果顯示，AR7可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)circPLCE1對HK2和PKM2蛋白表達(dá)的上調(diào)，表明circPLCE1可能與CMA活性相關(guān)。在A549細(xì)胞中同時過表達(dá)circPLCE1和HSC70，HSC70過表達(dá)也可逆轉(zhuǎn)circPLCE1過表達(dá)引起的HK2和PKM2表達(dá)增加，進(jìn)一步說明circPLCE1通過HSC70調(diào)控CMA底物。
此外，作者使用含有KFERQ基序的融合蛋白可視化CMA活性，IF結(jié)果顯示，過表達(dá)circPLCE1后，紅色熒光斑點的數(shù)量顯著減少，CMA活性降低。上述結(jié)果表明，circPLCE1可以通過HSC70調(diào)控CMA活性。
研究表明，CMA與巨自噬密切相關(guān)，但CMA與巨自噬之間的相互作用尚未闡明。因此，作者試圖探究circPLCE1是否可以通過CMA通路調(diào)控巨自噬的關(guān)鍵蛋白，從而調(diào)控巨自噬。
Co-IP和IF實驗顯示，HSC70可以與巨自噬的關(guān)鍵蛋白（ATG5）相互作用且共定位。因ATG5含有三個KFERQ基序（KDVLR、DKVKK和FRIYQ），提示其可能是潛在的CMA底物蛋白。肺癌細(xì)胞經(jīng)血清饑餓或是AR7處理后，ATG5蛋白表達(dá)下降，驗證了ATG5作為CMA底物蛋白參與調(diào)控的猜想。
Western blot和免疫組化結(jié)果表明，過表達(dá)circPLCE1可促進(jìn)ATG5的蛋白表達(dá)，AR7處理或者HSC70過表達(dá)則逆轉(zhuǎn)該趨勢。綜上，circPLCE1可以通過靶向HSC70抑制CMA活性，并通過CMA通路增加ATG5蛋白表達(dá)。
圖6 circPLCE1通過CMA通路調(diào)控ATG5蛋白的表達(dá)
上述結(jié)果表明，circPLCE1通過抑制CMA導(dǎo)致ATG5表達(dá)增加。因此，作者進(jìn)一步探究circPLCE1是否可以通過調(diào)控ATG5依賴的巨自噬來抑制肺癌進(jìn)展。
流式檢測、MDC染色和CYTO-ID染色結(jié)果顯示，circPLCE1可正向調(diào)控巨自噬。Western blot分析A549細(xì)胞中ATG12和自噬標(biāo)志物（P62和LC3B）的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)circPLCE1正向調(diào)控ATG12蛋白和LC3B蛋白的表達(dá)，負(fù)向調(diào)控P62蛋白表達(dá)。
隨后，通過免疫組化和Western blot分析裸鼠腫瘤中自噬標(biāo)志物P62和LC3B的表達(dá)，結(jié)果顯示，穩(wěn)定過表達(dá)circPLCE1的裸鼠腫瘤中P62表達(dá)降低，而LC3B表達(dá)增加，驗證了circPLCE1在體內(nèi)外對巨自噬的促進(jìn)作用。沉默ATG5則可抑制circPLCE1過表達(dá)對巨自噬的正向調(diào)控作用，表明circPLCE1通過ATG5依賴的途徑促進(jìn)巨自噬。
為了進(jìn)一步探究HSC70介導(dǎo)的CMA下調(diào)在肺癌進(jìn)展中的作用，流式檢測circPLCE1和HSC70同時過表達(dá)后細(xì)胞自噬水平的變化，發(fā)現(xiàn)HSC70過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)circPLCE1過表達(dá)引起的巨自噬增加，表明circPLCE1可通過靶向HSC70促進(jìn)巨自噬。
隨后，CCK-8實驗、EdU細(xì)胞增殖和流式實驗結(jié)果顯示，HSC70過表達(dá)抑制了circPLCE1過表達(dá)引起的細(xì)胞活力下降、細(xì)胞增殖能力下降及細(xì)胞凋亡的增加。綜上所述，可得出結(jié)論：circPLCE1能夠靶向HSC70，抑制CMA活性，并通過CMA通路促進(jìn)ATG5依賴的巨自噬，從而抑制肺癌進(jìn)展。
圖7 circPLCE1通過靶向HSC70抑制肺癌進(jìn)展，并通過CMA通路調(diào)節(jié)ATG5依賴的巨自噬
研究結(jié)論
本研究揭示了環(huán)狀RNAs上存在o8G修飾，以及o8G修飾的環(huán)狀RNAs在肺癌進(jìn)展中的重要作用。AUF1能夠作為特異性識別circPLCE1的ROS介導(dǎo)o8G修飾的‘reader’，進(jìn)而調(diào)控其穩(wěn)定性并促進(jìn)其降解。
作者闡明了一種新的分子機制，通過circPLCE1靶向HSC70蛋白，提高其泛素化水平，抑制CMA活性，并通過CMA途徑促進(jìn)ATG5依賴的巨自噬，改變腫瘤細(xì)胞的命運，最終抑制肺癌的進(jìn)展，為肺癌進(jìn)展的分子機制以及肺癌治療的潛在靶點提供了新的見解。
吉滿生物
如想了解更多質(zhì)粒構(gòu)建、病毒包裝、穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建、敲除細(xì)胞株、報告基因檢測等相關(guān)服務(wù)。歡迎訪問吉滿生物官網(wǎng)：
免費咨詢電話：400-627-9288
