內(nèi)參抗體
在Western Blot實(shí)驗(yàn)中，可能存在總蛋白濃度測定不準(zhǔn)確，或者蛋白質(zhì)樣品在電泳前上樣時(shí)產(chǎn)生的樣品間的操作誤差；這些誤差可以通過測定每個(gè)樣品中實(shí)際轉(zhuǎn)到膜上的內(nèi)參含量來進(jìn)行校正。
內(nèi)部參照即選取相同樣本中某個(gè)內(nèi)源表達(dá)的蛋白作為參照。通常會選擇由管家基因編碼的蛋白(Housekeeping Proteins)作為內(nèi)參，它們在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測蛋白的表達(dá)水平變化可以作為一個(gè)穩(wěn)定的參照物(比如GAPDH、β-Actin等)。
在WB實(shí)驗(yàn)中，蛋白的表達(dá)情況是通過與抗體的結(jié)合而體現(xiàn)的，也就是說內(nèi)參蛋白的選擇問題等同于內(nèi)參抗體的選擇問題。點(diǎn)擊了解產(chǎn)品
如何選擇內(nèi)參抗體
一、樣本種屬來源
選擇內(nèi)參首先要考慮的就是實(shí)驗(yàn)樣本來源于什么物種，哺乳動(dòng)物的組織或者細(xì)胞樣本，通常選擇β-actin、GAPDH、β-tubulin等。
二、目的蛋白分子量
選擇內(nèi)參抗體時(shí)，應(yīng)該考慮目的蛋白分子量的大小。通常目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量應(yīng)該相差5KD以上。比如目的蛋白分子量為45KD，不適宜選擇β-actin(42KD)作為內(nèi)參，可以考慮選擇GAPDH(36KD)作為內(nèi)參。
三、目的蛋白表達(dá)部位
首先需要進(jìn)行亞細(xì)胞定位，再確定目的蛋白的組織表達(dá)部位，一般的蛋白檢測常用，β-actin，GAPDH等。
β-Actin抗體
beta Actin(肌動(dòng)蛋白，細(xì)胞骨架蛋白)，375個(gè)氨基酸組成，分子量大小為42-43kDa左右。它們在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來做參照物。beta Actin 作為內(nèi)參是得到公認(rèn)的，針對大多數(shù)組織和細(xì)胞來說，它廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，表達(dá)量非常豐富。但是在一些少量特殊的情況下比如脂肪組織和細(xì)胞內(nèi)，beta Actin 的表達(dá)量就很少。
產(chǎn)品推薦
名稱：Anti-β-Actin mIgG2a Antibody
貨號：GM-77430AB
規(guī)格：10 μg/100 μg/1 mg
吉滿優(yōu)勢
1.高親和力，高特異性，批次間穩(wěn)定
2.WB建議稀釋比例：1:1000-1:5000
3.適用種屬包括Human,Chinese hamster,Mouse,Dog和Rat等
數(shù)據(jù)展示
用HEK-293、Hepal-6、PC12、CHO-K1、MDCK細(xì)胞進(jìn)行WB驗(yàn)證分析，上樣后120 V進(jìn)行電泳，300 mA、1.5h進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%脫脂奶粉封閉兩小時(shí)，使用actin抗體(Catalog#GM-77430AB)(1:1000稀釋)，在搖床上4℃孵育過夜，用1×TBST清洗三次后添加二抗，搖床室溫孵育2-3 h，用1×TBST清洗三次后進(jìn)行顯影。
GAPDH抗體
GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)，是參與糖酵解的一種關(guān)鍵酶，由4個(gè)30-40kDa的亞基組成，分子量146kDa，檢測條帶大約在36kDa。
GAPDH基因幾乎在所有組織細(xì)胞中都高水平表達(dá)，在同種細(xì)胞或組織中的表達(dá)量一般是恒定的，且很少受外部誘導(dǎo)物的影響，廣泛用作WB蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參。但比如缺氧和糖尿病等疾病存在下，會增加 GAPDH 在特定細(xì)胞和組織中的表達(dá)。
產(chǎn)品推薦
名稱：Anti-GAPDH mIgG2a Antibody
貨號：GM-77904AB
規(guī)格：10 μg/100 μg/1 mg
吉滿優(yōu)勢
1.效價(jià)高，質(zhì)量穩(wěn)定
2.WB建議稀釋比例：1:1000-1:5000
3.適用種屬包括Human, Mouse, Dog, Rat, Pig
數(shù)據(jù)展示
用HEK-293,Jurkat,PC12,WSL,Hepal-6和MDCK 細(xì)胞進(jìn)行WB驗(yàn)證分析。上樣后，在120V下電泳，然后在 300mA下轉(zhuǎn)膜1.5小時(shí)。轉(zhuǎn)膜后，細(xì)胞用 5%脫脂奶粉封閉兩小時(shí)。使用GAPDH抗體(Catalog#GM-77904AB)(1:1000 稀釋度)，4℃搖床孵育過夜，加入二抗前用1×TBST 沖洗三次，室溫?fù)u床孵育2-3 小時(shí)，顯像前用1×TBST 沖洗三次。
兩種內(nèi)參的區(qū)別
Actin是結(jié)構(gòu)蛋白，不同組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)會有差異性，表達(dá)量也可能會不一樣。
GAPDH是代謝類蛋白，在活組織中表達(dá)比較穩(wěn)定。但是做誘導(dǎo)后樣本或檢測磷酸化等修飾性抗體時(shí)，GAPDH表達(dá)量有可能會受到誘導(dǎo)處理的影響。
