研究背景
動脈粥樣硬化是糖尿病的大血管并發(fā)癥之一，糖尿病是動脈粥樣硬化疾病發(fā)生發(fā)展的主要危險因素。越來越多的研究表明，內(nèi)皮細胞（ECs）中的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是糖尿病相關(guān)并發(fā)癥發(fā)病機制的核心角色。因此可以通過靶向內(nèi)皮氧化應(yīng)激，以降低內(nèi)皮功能障礙，從而糖尿病加速動脈粥樣硬化。
Nrf2是一種內(nèi)源性抗氧化劑，對氧化應(yīng)激相關(guān)疾病具有巨大的治療作用。正常狀態(tài)下，Nrf 2與Keapl識別并形成聚合物，其作用會被Keap 1抑制；在氧化應(yīng)激等狀態(tài)下，Nrf 2與Keap解離被激活，并進入細胞核與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，導(dǎo)致幾種抗氧化蛋白（如血紅素加氧酶HO-1）的表達。在氧化應(yīng)激過程中，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶（NOX）被描述為活性氧（ROS）產(chǎn)生的主要來源。
NOX2被認為是心血管細胞中ROS的主要來源，其中p47phox的磷酸化是NOX2復(fù)合物組裝和該酶激活的關(guān)鍵步驟。有趣的是，細胞質(zhì)p47phox在物理上與Nrf2結(jié)合，增加Nrf2的核積累，導(dǎo)致Nrf2依賴的基因的上調(diào)。也就是說，通過破壞Keap1/Nrf2復(fù)合物和增強p47phox/Nrf2復(fù)合物來激活Nrf2通路可能是預(yù)防和治療糖尿病相關(guān)并發(fā)癥，如動脈粥樣硬化的一種前瞻性方法。
文獻來源
近日，中國藥科大學(xué)藥學(xué)院孫海建課題組等人在Cell Death & Disease發(fā)表 “A dual Keap1 and p47phox inhibitor Ginsenoside Rb1 ameliorates high glucose/ox-LDL-induced endothelial cell injury and atherosclerosis”的研究性論文，作者報道了人參皂苷Rb1在抑制Keap1和p47phox熒光素酶報告基因活性方面具有雙重作用，并闡明了Rb1預(yù)處理對內(nèi)皮細胞(ECs)損傷的保護作用及其分子機制。
Rb1預(yù)處理對內(nèi)皮細胞（ECs）保護作用
利用379種天然產(chǎn)物的熒光素酶報告基因分析，作者報道了人參皂苷Rb1在Keap1和p47phox熒光素酶報告基因活性方面發(fā)揮了雙重抑制作用。隨后，用不同濃度的Rb1預(yù)處理EA.hy926細胞30分鐘，然后ox-LDL/HG處理24小時達到誘導(dǎo)動脈粥硬化的目的，結(jié)果顯示Rb1預(yù)處理增強了EA.hy926內(nèi)皮細胞活力，降低了氧化應(yīng)激、炎癥、內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT）和凋亡，并改善了氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）加高糖（HG）刺激后的線粒體質(zhì)量。
Rb1直接與Keap1結(jié)合并促進其降解
分子對接分析找到了Rb1和Keap1結(jié)合的2個作用位點(包含Tyr525、Ser508、Arg415、Asp573、Val467)，結(jié)合表面等離子體共振(SPR)和微尺度熱電泳(MST)結(jié)果揭示了Rb1與Keap1的潛在相互作用。在Keap1的Tyr525,Ser508,Arg415,Asp573和Val467殘基突變?yōu)楸彼岷?，Rb1在ox-LDL/hg培養(yǎng)的細胞中，Rb1的抗氧化和線粒體保護作用顯著減弱。在ox-LDL/HG的存在下，Keap1蛋白減少，而Nrf2下游靶基因HO-1蛋白增加，可能是對氧化應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)，而Rb1進一步增強了這種反應(yīng)，提示Rb1可能通過抑制Keap1成為Nrf2的潛在激活因子。通過COIP實驗進一步表明Rb1降低了ox-LDL/HG暴露的ECs中Nrf2/Keap1的相互作用。
針對核質(zhì)提取物的蛋白分析顯示，Rb1促進了Nrf2在ECs中的核積累，免疫熒光與此一致，Rb1處理的EC細胞中Nrf2的核染色更多。此外，許多轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄共激活因子參與了線粒體的生物發(fā)生，包括Nrf1、Nrf2和PGC-1α，檢測結(jié)果顯示ox-LDL/HG降低了PGC-1α和Nrf1的蛋白表達，而Rb1預(yù)處理則挽救了這些蛋白的表達，并且Rb1有助于增強PGC-1α/Nrf2的結(jié)合。這說明了通過Nrf2激活促進線粒體生物發(fā)生是Rb1保護線粒體完整性免受ox-LDL/HG損傷的另一種方式。然而，利用si-Nrf2和si-PGC-1α消除了Rb1介導(dǎo)的保護作用。
(Rb1促進Nrf2與Keap1的解離，并誘導(dǎo)Nrf2與PGC-1α的相互作用)
SYVN1被鑒定為Keap1的E3連接酶
作者進一步研究了Rb1是否在翻譯后修飾水平調(diào)控Keap1的表達。用MG132蛋白酶體抑制劑處理后，逆轉(zhuǎn)了Rb1對Keap1蛋白水平的影響，而氯喹處理無變化，即Rb1通過蛋白酶體降解破壞了Keap1的穩(wěn)定性。其次，Rb1在CHX的存在下加速了Keap1的降解，加速了Keap1的泛素化。利用生信預(yù)測篩選了導(dǎo)致keap1蛋白酶體降解E3連接酶的5個候選分子（CBL、SYVN1、PJA2、MIB2和BRCA1），只有SYVN1過表達導(dǎo)致Keap1蛋白顯著降低。采用免疫共沉淀法檢測到Keap1與SYVN1存在直接相互作用，且si-SYVN1 阻斷了Rb1對EC中Keap1蛋白水平的抑制作用。以上結(jié)果表明SYVN1是Keap1的真正E3連接酶。
(SYVN1被鑒定為Keap1的E3連接酶，介導(dǎo)Rb1誘導(dǎo)的其降解)
Rb1促進syvn1介導(dǎo)的Keap1在K108、K323和K551位點的泛素化
使用BDM-PUB數(shù)據(jù)庫(http://bdmpub.biocuckoo.org/podece.php)預(yù)測有5個賴氨酸殘基是Keap1的泛素化位點，當(dāng)K108、K323和K551突變?yōu)楸彼釙r，Rb1對Keap1的降解和泛素化作用減弱，同時突變后Rb11誘導(dǎo)的Keap1蛋白酶體降解具有抗性。到此可以得出，Rb1促進syvn1介導(dǎo)的Keap1在K108、K323和K551位點的泛素化，導(dǎo)致Keap1蛋白降解。
(Rb1促進syvn1介導(dǎo)的keap1 在K108、K323和K551處的泛素化)
Rb1直接與p47phox結(jié)合并增強其去磷酸化
鑒于Rb1對p47phox熒光素酶報告基因的抑制作用，Rb1與p47phox之間是否存在直接的相互作用，展開了部分研究。通過分子對接分析表明Rb1與p47phox存在結(jié)合作用。Rb1預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)ox-LDL/hg暴露下NOX2和p22phox蛋白表達水平的升高，降低了p47phox、總p47phox的磷酸化水平，但不改變總p67phox的磷酸化水平。
免疫沉淀顯示Rb1預(yù)處理阻止了ox-LDL/HG誘導(dǎo)的p47phox/p22phox復(fù)合物和p47phox/p67phox復(fù)合物的形成，表明Rb1可能是NOX2的潛在抑制劑。Rb1的預(yù)處理破壞了Keap1與ox-LDL/HG誘導(dǎo)的p47phox的關(guān)聯(lián)，但導(dǎo)致在ox-LDL/HG環(huán)境中，p47phox與Nrf2的相互作用增加。本部分得出Rb1直接與p47phox結(jié)合并增強其去磷酸化，增加了p47phox與Nrf2的相互作用。
(Rb1增強了p47phox的去磷酸化和細胞質(zhì)豐度，并促進了p47phox和Nrf2的相互作用)
Rb1可保護糖尿病ApoE?/?小鼠的動脈粥樣硬化病變
在動物實驗中，作者通過尾靜脈注射Tie-Nrf2 shRNA，Tie-PGC-1α shRNA（AAV9，5 × 1011 viral particles， Genomeditech）和對照腺相關(guān)病毒，取樣檢測，發(fā)現(xiàn)與糖尿病ApoE?/?小鼠相比，Rb1處理后的小鼠主動脈動脈粥樣硬化病變大受抑制，Nrf2或PGC-1α缺失后，Rb1并不能減弱動脈粥樣硬化斑塊的形成。主動脈根部的H&E染色和Oil O Red染色也檢測到類似的結(jié)果，主動脈切片DHE染色顯示，糖尿病動脈粥樣硬化小鼠超氧陰離子的產(chǎn)生增加，而Rb1治療的抑制作用依賴于Nrf2和PGC-1α的存；糖尿病性ApoE?/?小鼠內(nèi)皮細胞中促炎因子VCAM-1、IL-1β、IL-6、TNF-α的含量明顯升高，經(jīng)Rb1處理后被清除。內(nèi)皮細胞中Nrf2或PGC-1α的特異性缺失消除了Rb1在模型小鼠主動脈中的抗炎作用。
(Nrf2和PGC-1α是Rb1改善糖尿病加速動脈粥樣硬化所必需的)
綜上所述，在內(nèi)皮細胞(ECs)中，Rb1預(yù)處理增強了細胞活力，降低了氧化應(yīng)激、炎癥、內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndMT)和凋亡，并改善了氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)加高糖(HG)刺激后的線粒體質(zhì)量。Rb1通過招募SYVN1，通過賴氨酸殘基(K108,K323,K323和K551)促進其泛素化和蛋白酶體降解，導(dǎo)致Nrf2從Keap1解離，Nrf2核易位，Nrf2/PGC-1α復(fù)合體形成。進一步發(fā)現(xiàn)，Rb1可以與p47phox結(jié)合，降低其磷酸化和膜易位，從而破壞NOX2復(fù)合物的組裝。更重要的是，Rb1介導(dǎo)的細胞質(zhì)p47phox的保存穩(wěn)定并有助于Nrf2的激活。此外，在鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的ApoE?/?小鼠中，Rb1減少了主動脈粥樣硬化斑塊的形成，并減少了氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，但在Nrf2和PGC-1α缺乏的ApoE?/?小鼠中沒有。總之，本文證明了直接靶向Rb1的Keap1和p47phox，可能是治療糖尿病動脈粥樣硬化的一個有吸引力的候選藥物。
吉滿助力
本研究中所用報告基因質(zhì)粒PGL3-basic-HKeap1 luciferase reporter gene plasmids,PGL3-basic-H-p47phox luciferase reporter gene plasmids和腺相關(guān)病毒GPAAV-tie-eGFP-5’mir30-Mouse-Nfe2l2(Nrf2)-shRNA3-3’mir30-tie enhancer CW3SL and GPAAV-tie-eGFP-5’mir30-MousePpargc1a(PGC1-α)-shRNA3-3’mir30-tie enhancer CW3SL 均由吉滿生物提供。
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