骨肉瘤（osteosarcoma）是一種由原始間充質(zhì)細(xì)胞形成的致命原發(fā)性骨骼腫瘤，具有高轉(zhuǎn)移潛能，很容易轉(zhuǎn)移到肺部，然后轉(zhuǎn)移到身體其他器官。骨肉瘤的高轉(zhuǎn)移潛力與低生存率相關(guān)，發(fā)生轉(zhuǎn)移性的患者5年生存率為20%。即使采用最佳誘導(dǎo)治療，30-40%的骨肉瘤患者復(fù)發(fā)率仍達(dá)80%，且極易在肺部復(fù)發(fā)。因此亟待明確轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的分子機(jī)制，以便開發(fā)有效的治療干預(yù)措施。
中國醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)院等發(fā)表在International Journal of Biological Sciences雜志中題為：Apelin promotes osteosarcoma metastasis by upregulating PLOD2 expression via the Hippo signaling pathway and hsa_circ_0000004/miR-1303 axis的研究，探究了促進(jìn)骨肉瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，即一種脂肪因子Apelin (APLN)通過Hippo信號通路與hsa_circ_0000004/miR-1303信號軸上調(diào)PLOD2的表達(dá)，從而促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞的遷移。
細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的轉(zhuǎn)化在骨肉瘤的增殖和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用，其主要成分膠原蛋白，為ECM的組裝提供了支架。膠原蛋白的交聯(lián)和沉積依賴于PLOD家族，部分研究顯示PLOD2在多種腫瘤中高表達(dá)，參與膠原交聯(lián)、膠原纖維互作和腫瘤運動等。Apelin(APLN)是G蛋白偶聯(lián)受體Aplin受體(APJ)的內(nèi)源性配體之一，是一種具有廣泛生理學(xué)功能的內(nèi)源性多肽，參與調(diào)節(jié)腫瘤增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移，能量代謝等生理學(xué)過程，見于非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌和膽管癌等多種癌癥，這也表明APLN在癌癥轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用，然而APLN和PLOD2是否影響骨肉瘤的遷移，作者展開了如下研究。
圖1 人骨肉瘤組織中APLN的臨床病理特征 圖2 APLN與PLOD2在人骨肉瘤組織中的表達(dá)呈正相關(guān) 作者進(jìn)一步研究了骨肉瘤轉(zhuǎn)移與APLN和PLOD2的作用機(jī)制，通過Transwell試驗、qPCR和Western blot分別檢測體外遷移活性、PLOD2 mRNA和蛋白的表達(dá)，證實了APLN劑量依賴性地促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的遷移，APLN通過刺激骨肉瘤細(xì)胞（143B和MG-63）使得PLOD2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加。在PLOD2抑制劑（米諾地爾）預(yù)處理或轉(zhuǎn)染PLOD2 siRNA的情況下，對APLN促遷移的作用產(chǎn)生了抑制。也就是說，在骨肉瘤中，APLN通過增加PLOD2的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞遷移。 圖3 APLN通過增加PLOD2表達(dá)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞遷移 為了探究更深入的機(jī)制作用，作者參考了在腫瘤轉(zhuǎn)移中可發(fā)揮重要作用并與骨肉瘤相關(guān)的PI3K/Akt/mTOR、NF-κB、JAK/STAT、Hippo和缺氧信號通路。通過qPCR檢測可推斷Hippo信號通路參與了APLN誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞遷移的過程。利用小干擾抑制Hippo通路關(guān)鍵分子MST1和MOB1表達(dá)后，可顯著抑制APLN對細(xì)胞遷移活動的影響，以及PLOD2 mRNA和蛋白表達(dá)水平。該部分結(jié)果說明了MST1/MOB1通路參與APLN誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞遷移并增加PLOD2的表達(dá)。 圖4 Hippo信號通路參與APLN誘導(dǎo)的PLOD2 mRNA表達(dá) 圖5 MST1/MOB1通路參與APLN誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞遷移并增加PLOD2的表達(dá) YAP作為Hippo通路的主要下游效應(yīng)分子，其激活可調(diào)控與增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)。使用YAP抑制劑及YAP siRNA實施阻斷后，APLN對細(xì)胞遷移的影響變?nèi)?，PLOD2 mRNA和蛋白的表達(dá)降低。此外，采用ChIP和qPCR驗證了YAP與PLOD2啟動子的調(diào)控互作。 圖6 YAP通路與APLN誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞遷移有關(guān)，并增加PLOD2的表達(dá) miRNAs能夠通過結(jié)合mRNA的3’-UTR調(diào)控蛋白編碼基因，在人類癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。為此進(jìn)一步檢索得到5個與PLOD2的3'-UTR結(jié)合miRNAs（miR-330-3p、miR-513a-3p、miR-944、miR-1303和miR-1305），其中miR-1303經(jīng)APLN處理驗證顯示表達(dá)明顯降低，且miR-1303水平受到濃度依賴的抑制；與正常骨組織相比，miR-1303在人骨肉瘤組織中的表達(dá)明顯下調(diào)；且miR-1303 mimic可以消除APLN誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和PLOD2表達(dá)的促進(jìn)。此外，雙熒光素酶報告基因檢測驗證了APLN與PLOD2可以直接相互作用。 圖7 APLN通過下調(diào)miR-1303的表達(dá)，增強(qiáng)PLOD2的表達(dá)并促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞遷移 環(huán)狀RNA(circular RNAs)被認(rèn)為是miRNA的海綿，導(dǎo)致miRNA功能受到抑制。經(jīng)由環(huán)狀RNA相互作用體分析，作者預(yù)測得到circ_0078767、circ_0094088、circ_0000004、circ_0000003、circ_0000051和circ_0000090可與miR-1303產(chǎn)生結(jié)合，且驗證發(fā)現(xiàn)其中circ_0000004在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)量最高。為了進(jìn)一步明確circ_0000004和miR-1303對骨肉瘤細(xì)胞的作用機(jī)制，作者使用了小干擾抑制、熒光素酶報告基因檢測、Pull-down試驗及mRNA測定，證實了APLN通過上調(diào)circ_0000004抑制miR-1303的表達(dá)，進(jìn)而解除對下游靶基因PLOD2的抑制作用，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的遷移能力。 圖8 APLN通過上調(diào)miR-1303的circ_0000004海綿作用來增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞遷移，并增加PLOD2的表達(dá) 為了進(jìn)一步證實APLN在體內(nèi)對骨肉瘤細(xì)胞遷移和PLOD2表達(dá)的影響，作者建立了穩(wěn)定表達(dá)APLN shRNA細(xì)胞系，通過Western blot，生物發(fā)光成像監(jiān)測腫瘤轉(zhuǎn)移情況及免疫組化染色分別進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示APLN shRNA細(xì)胞系中APLN和PLOD2蛋白表達(dá)明顯受到抑制，細(xì)胞遷移顯著減少，APLN敲除能夠顯著抑制肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生。 圖9 敲除APLN可抑制肺轉(zhuǎn)移 綜上所述，作者研究表明APLN通過Hippo信號通路以及hsa_circ_0000004/miR-1303軸促進(jìn)PLOD2的表達(dá)和人骨肉瘤細(xì)胞的遷移，推斷APLN是轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的一個有希望的靶點。 圖10 圖示骨肉瘤轉(zhuǎn)移中APLN的參與過程 吉滿助力 吉滿生物（Genomeditech）可提供文章中涉及的不同形式質(zhì)粒構(gòu)建、報告基因檢測和功能表型（CCK-8增殖，遷移和侵襲）、WB等相關(guān)服務(wù)內(nèi)容，歡迎訪問吉滿生物官方網(wǎng)站：www.news.ytakw.cn，咨詢電話：400-627-9288 021-50432825
