文獻(xiàn)解讀
慶北國(guó)立大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與基質(zhì)研究所團(tuán)隊(duì)在《Cancer Communications》上發(fā)表了題目為“IL2-mediated modulation of small extracellular vesicles secretion and PD-L1 expression: a novel perspective for neutralizing immune suppression within cancer cells”的研究論文。
作者通過(guò)在小鼠和人黑色素瘤細(xì)胞、小鼠腫瘤模型上的實(shí)驗(yàn)表明黑色素瘤細(xì)胞特異性IL2刺激可以強(qiáng)烈抑制腫瘤生長(zhǎng)，降低腫瘤組織中Rab27a和 cPD-L1的表達(dá)，以及降低血漿中ePD-L1 的水平。IL2直接作用于癌細(xì)胞，通過(guò)IL2R-MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)減少sEV分泌和PD-L1表達(dá)。
研究背景
癌細(xì)胞分泌細(xì)胞外小囊泡（sEV），通過(guò)促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成來(lái)調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能，如腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。癌細(xì)胞通過(guò)上調(diào)細(xì)胞程序性死亡配體1（cPD-L1）的表面表達(dá)來(lái)逃避免疫監(jiān)視，cPD-L1與細(xì)胞毒性T細(xì)胞上的程序性細(xì)胞死亡1（PD-1）相互作用，抑制免疫反應(yīng)。此外，癌細(xì)胞釋放在其表面顯示PD-L1的sEVs[4]。
癌癥來(lái)源的外泌體PD-L1（ePD-L1）與癌細(xì)胞中的cPD-L1相似，可阻礙免疫細(xì)胞活化，誘導(dǎo)免疫抑制性腫瘤微環(huán)境。因此，調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中sEV分泌或PD-L1表達(dá)可能是改變腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵策略。
項(xiàng)目研究
作者首先在b16f10細(xì)胞上對(duì)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞sEV分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行了篩選鑒定，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素2（IL2）主要減少B16F10細(xì)胞中的sEV分泌，IL2是FDA批準(zhǔn)的一種常用于黑色素瘤療法的細(xì)胞因子，通常通過(guò)激活表達(dá)IL2受體復(fù)合物（IL2R）的免疫細(xì)胞來(lái)發(fā)揮抗癌作用。然而，IL2R也在某些類型的癌細(xì)胞中表達(dá)，包括黑色素瘤細(xì)胞。但是，IL2對(duì)表達(dá)IL2R的癌細(xì)胞的潛在影響尚未得到徹底研究。
圖1 從38個(gè)白細(xì)胞介素家族細(xì)胞因子中鑒定調(diào)節(jié)黑色素瘤細(xì)胞小細(xì)胞外囊泡（sEV）分泌的細(xì)胞因子
用IL2處理表達(dá)IL2R的小鼠和人黑色素瘤細(xì)胞，隨后分離sEV用于評(píng)估IL2對(duì)sEV分泌的影響。
與PBS對(duì)照組相比，IL2減少了分泌的sEV的數(shù)量并顯著降低了RabGTP酶的表達(dá)，RabGTP酶可以調(diào)節(jié)黑色素瘤細(xì)胞中sEV的生物發(fā)生和分泌。這種效應(yīng)與以前已知的IL2對(duì)免疫細(xì)胞中sEV調(diào)節(jié)的影響不同。
圖2 白細(xì)胞介素-2（IL2）有效抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞的sEV分泌
除了研究IL2對(duì)癌細(xì)胞分泌sEVs的影響外，作者還研究了其對(duì)免疫檢查點(diǎn)的影響，免疫檢查點(diǎn)是免疫監(jiān)視的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。有趣的是，IL2治療顯著降低了黑色素瘤細(xì)胞cPD-L1水平，但不影響細(xì)胞增殖。
圖3 IL2對(duì)黑色素瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)的抑制作用
接下來(lái)，作者評(píng)估了IL2對(duì)ePD-L1的調(diào)節(jié)是否影響CD8+T細(xì)胞活性。用PBS處理的B16F10細(xì)胞的sEV顯著降低了CD8+T細(xì)胞中的顆粒酶B水平，而用IL2處理的B16F10細(xì)胞的sEV則沒(méi)有這種現(xiàn)象。
sEVs對(duì)CD8+T細(xì)胞活化的抑制作用可以被抗PD-L1抗體消除。此外，作者觀察到IL2介導(dǎo)的黑色素瘤細(xì)胞衍生的ePD-L1的表達(dá)降低增強(qiáng)了CD8+T細(xì)胞與癌細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞毒性作用。這些數(shù)據(jù)表明，IL2引起的ePD-L1降低促進(jìn)了CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性和癌細(xì)胞死亡。
圖4 IL2通過(guò)降低外泌體PD-L1（ePD-L1）水平，增加CD8+T細(xì)胞對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用
隨后，分析了IL2在癌細(xì)胞中的作用是否取決于IL2R信號(hào)傳導(dǎo)。IL2RB-IL2RG復(fù)合物的形成對(duì)于IL2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要。結(jié)果表明IL2RB和IL2RG的中和抗體恢復(fù)了IL2介導(dǎo)的Rab27a表達(dá)降低、sEV分泌減少以及cPD-L1和ePD-L1表達(dá)的降低。同樣，IL2RB敲低消除了癌細(xì)胞中IL2介導(dǎo)的上述調(diào)節(jié)作用。
圖5 IL2R依賴的黑色素瘤細(xì)胞中sEV分泌和PD-L1表達(dá)的調(diào)節(jié)
接下來(lái)，作者探索了IL2在黑色素瘤細(xì)胞中發(fā)揮作用的信號(hào)通路。IL2有效增加了黑色素瘤細(xì)胞中的ERK磷酸化，而STAT5和AKT磷酸化不受影響。
與使用STAT5抑制劑或PI3K抑制劑治療不同，用IL2和MEK抑制劑共同處理黑色素瘤細(xì)胞消除了IL2對(duì)sEV分泌和PD-L1表達(dá)的抑制作用。表達(dá)dominant-negative ERK1的黑色素瘤細(xì)胞在IL2處理后磷酸化ERK、Rab27a和PD-L1水平?jīng)]有改變。此外，MEK抑制劑減弱了黑色素瘤細(xì)胞對(duì)IL2誘導(dǎo)的T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的敏感性增加。綜上所述，這些結(jié)果表明IL2通過(guò)IL2R-MEK/ERK軸調(diào)節(jié)黑色素瘤細(xì)胞功能。
圖6 黑色素瘤細(xì)胞中IL2對(duì)sEV分泌和PD-L1表達(dá)的MEK/erk依賴性調(diào)節(jié)
作者驗(yàn)證了在細(xì)胞水平觀察到的IL2對(duì)癌細(xì)胞的影響是否可以擴(kuò)展到小鼠腫瘤模型。于是開(kāi)發(fā)了一種新方法，通過(guò)使用柔性接頭將IL2錨定到癌細(xì)胞質(zhì)膜上來(lái)分析IL2在體內(nèi)的癌細(xì)胞特異性作用，從而實(shí)現(xiàn)無(wú)擴(kuò)散的自我刺激。應(yīng)用這種方法，可以觀察到IL2處理和膜錨定IL2（IL2-T）小鼠的腫瘤生長(zhǎng)顯著減少，體重沒(méi)有變化，但在對(duì)照小鼠中則沒(méi)有。與對(duì)照小鼠相比，IL2-T小鼠與可溶性IL2處理的小鼠一樣，腫瘤組織中Rab27a和cPD-L1的表達(dá)降低，血漿中ePD-L1的水平降低。這表明IL2的癌細(xì)胞特異性刺激可以限制癌細(xì)胞活性，例如sEVs分泌和PD-L1表達(dá)，類似于全身性IL2給藥。
圖7 附著在黑色素瘤細(xì)胞表面的IL2對(duì)癌細(xì)胞起特異性作用
圖8 在同基因小鼠模型中，IL2作用于黑色素瘤細(xì)胞，降低Rab27a和PD-L1的水平
在之前的同基因小鼠腫瘤模型中，PD-L1可以在癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞中表達(dá)，這導(dǎo)致血漿ePD-L1來(lái)源的不確定性。為了特異性分析癌細(xì)胞來(lái)源的ePD-L1，將人癌細(xì)胞移植到裸鼠體內(nèi)，并測(cè)量人ePD-L1水平。正如預(yù)期的那樣，IL2顯著抑制了腫瘤組織中Rab27a和PD-L1的表達(dá)。與同基因小鼠結(jié)果一致，IL2治療顯著降低了人黑色素瘤細(xì)胞衍生的ePD-L1的血漿水平。這些數(shù)據(jù)表明IL2可以在體內(nèi)降低癌細(xì)胞衍生的ePD-L1。
圖9 IL2可降低小鼠異種移植瘤模型中Rab27a和PD-L1的水平
為了將這些發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展到其他癌癥類型，作者研究了IL2對(duì)人類肺癌細(xì)胞的影響。IL2治療下調(diào)了表達(dá)IL2R的肺癌細(xì)胞中的Rab27a和PD-L1水平，但在不表達(dá)IL2R的肺癌細(xì)胞中無(wú)下調(diào)。
此外，檢查患者來(lái)源的肺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IL2顯著降低了來(lái)自7個(gè)供體的表達(dá)IL2R的肺癌樣本中的Rab27a和cPD-L1水平。這些數(shù)據(jù)表明，IL2對(duì)癌細(xì)胞的影響在人類、小鼠和異質(zhì)細(xì)胞類型中是保守的，為IL2機(jī)制提供了新的臨床見(jiàn)解。
圖10 IL2可降低表達(dá)IL2R的肺癌細(xì)胞中Rab27a和PD-L1的表達(dá)
圖11 肺癌患者腫瘤細(xì)胞中IL2R的表達(dá)
研究結(jié)論
目前對(duì)IL2的研究主要集中在免疫細(xì)胞上，然而它在非免疫細(xì)胞（尤其是癌細(xì)胞）中的關(guān)鍵功能仍然知之甚少。
本研究表明，IL2直接作用于癌細(xì)胞，通過(guò)IL2R-MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)減少sEV分泌和PD-L1表達(dá)。在小鼠腫瘤模型中，黑色素瘤細(xì)胞特異性IL2刺激強(qiáng)烈抑制腫瘤生長(zhǎng)，降低腫瘤組織中Rab27a和cPD-L1的表達(dá)，以及血漿中ePD-L1的水平。此外，IL2的療效在患者來(lái)源的肺腫瘤細(xì)胞中得到證實(shí)，表明IL2在表達(dá)IL2R的腫瘤患者中具有潛在的臨床意義。
這些發(fā)現(xiàn)提供了見(jiàn)解，通過(guò)提出新的免疫腫瘤學(xué)機(jī)制，可能拓寬IL2的臨床適用性。進(jìn)一步研究IL2對(duì)表達(dá)IL2R的癌癥的直接影響，可能需要重新考慮將IL2作為各種癌癥的重要治療選擇。
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