背景介紹
Cre 重組酶(Cyclization Recombination Enzyme, 即環(huán)化重組酶)，是細(xì)菌噬菌體P1的I型拓?fù)洚悩?gòu)酶。其基因編碼區(qū)序列全長1029bp，為38kDa大小的、由343個氨基酸組成的多肽單體蛋白。Cre重組酶的C-末端結(jié)構(gòu)域包含催化活性位點，能夠催化DNA分子中特定位點之間的重組。而且與限制酶相似，能識別特異的DNA序列，即loxP位點，使loxP位點間的基因序列被刪除或重組。
LoxP序列 locus of X (cross)-over in P1)，是位于P1噬菌體中長度為34bp的一段序列，由兩個13bp的反向回文序列和8bp的中間間隔序列共同組成，反向回文序列是Cre重組酶的識別和結(jié)合區(qū)域，間隔序列決定LoxP序列的方向。loxP有多種突變類型，多種突變類型之間不交叉識別。
Cre-loxP系統(tǒng)基因重組原理
一般而言，當(dāng)細(xì)胞基因組內(nèi)存在兩個LoxP位點時，Cre重組酶會誘導(dǎo)兩個LoxP位點間的序列發(fā)生重組。
Cre-loxP誘導(dǎo)基因重組的方式
Cre重組酶介導(dǎo)兩個LoxP位點間的重組是一個動態(tài)、可逆的過程，重組的結(jié)果取決于兩個loxP位點的方向，主要有以下情況：
1、刪除（Deletion）
如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個LoxP位點間的序列
2、倒轉(zhuǎn)（Inversion）
如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導(dǎo)致兩個LoxP位點間的序列倒轉(zhuǎn)
3、易位（Translocation）
如果兩個LoxP位點分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre酶能介導(dǎo)兩條DNA鏈的交換或染色體易位，即基因轉(zhuǎn)座
4、序列互換(Cassette exchange)
如果四個loxP位點分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre重組酶能誘導(dǎo)loxP間的序列互換(cassette exchange)
兩種策略實現(xiàn)Cre依賴的基因表達(dá)
1、DIO序列策略
DIO序列策略的關(guān)鍵在于引入兩對不同的lox位點：LoxP和Lox2272。在Cre酶的作用下，不論是識別LoxP還是Lox2272位點，第一步都可以實現(xiàn)目標(biāo)基因的反轉(zhuǎn)。反轉(zhuǎn)會使兩個loxP位點或者Lox2272位點變成同向。第二步在Cre酶的作用下，剪切刪除一個LoxP位點和一個Lox2272位點，進(jìn)而實現(xiàn)基因的穩(wěn)定表達(dá)。
2、LSL序列策略
LSL序列策略是將LoxP和轉(zhuǎn)錄中止盒插入啟動子和目的基因中間，構(gòu)成轉(zhuǎn)錄“終止盒”(Lox-stop-Lox)，這個“終止盒”能夠終止基因的轉(zhuǎn)錄。在沒有Cre酶的作用下，轉(zhuǎn)錄終止盒下游靶基因完全不表達(dá)。但是如果細(xì)胞中有Cre酶，終止盒會被Cre酶切除，從而實現(xiàn)組織特異性的基因過表達(dá)。
Cre/loxP條件性重組改造
經(jīng)過現(xiàn)代基因工程方法對Cre和LoxP元件的改造，Cre-LoxP系統(tǒng)實現(xiàn)了更加豐富的條件性重組策略。
1、對Cre元件的改造
提高Cre重組酶活性；構(gòu)建可誘導(dǎo)的方式
2、對loxP元件的改造
對間隔區(qū)和回文序列進(jìn)行突變，突變后的序列依然能被Cre重組酶識別和重組，但是突變的loxP序列必須和同樣突變的loxP序列匹配介導(dǎo)基因重組，在同一Cre重組酶的作用下，可以實現(xiàn)多序列的基因重組，產(chǎn)生非常多元的重組結(jié)果。下表為常見的loxP類型：
LoxP位點及其突變體位點
Cre-loxP系統(tǒng)的優(yōu)點
1、高效性
Cre重組酶與具有l(wèi)oxP位點的DNA片段形成復(fù)合物之后，可以提供足夠的能力引發(fā)之后的DNA重組過程，重組過程簡約高效；重組不受切除片段長短及位置影響，可以在活體動物體內(nèi)實現(xiàn)，可隨細(xì)胞分裂和動物傳代穩(wěn)定遺傳。
2、特異性強
loxP位點是一段含回文序列結(jié)構(gòu)和中間有間隔的34bp元件，這種結(jié)構(gòu)保證了loxP序列的唯一性，從而保證基因重組的特異性很強；在動物模型中至今未發(fā)現(xiàn)Loxp位點之外的非特異性重組，只在體外實驗中有少量報道。
3、應(yīng)用范圍廣
Cre重組酶是一種比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，可以在生物體不同的組織、不同的生理條件下發(fā)揮作用，所以說Cre-loxP系統(tǒng)的可應(yīng)用范圍非常廣。
4、快速性
動物實驗已證實在受精卵分裂前的短時間內(nèi)，Cre介導(dǎo)的特異性重組便會完成。
5、時空特異性
如果將Cre結(jié)構(gòu)基因置于某一特定啟動子或其他調(diào)節(jié)基因控制之下，便會實現(xiàn)Cre酶蛋白在特定組織和特定時間的可控型表達(dá)，繼而限定了重組發(fā)生的時空性。
Cre-LoxP重組系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用
病毒依賴的基因重組的優(yōu)勢
1、更強的區(qū)域特異性
由于病毒可以通過局部注射的方式保證區(qū)域特異性感染，再加上驅(qū)動Cre基因的特異性啟動子，能夠?qū)崿F(xiàn)更強的區(qū)域和細(xì)胞特異性的基因重組。
2、更少的花費
購買轉(zhuǎn)基因動物的費用一般是比較昂貴的，而且轉(zhuǎn)基因動物的飼養(yǎng)、基因型鑒定都需要不少的人力、物力，而病毒的制備、保存和注射所花的費用相對來說是比較少的。
3、更短的實驗周期
