研究背景
嚙齒動(dòng)物和人類(lèi)的數(shù)據(jù)都表明，肝臟中的sn-1,2-二酰基甘油(sn-1,2-DAG)作為第二信使直接過(guò)度激活蛋白激酶C(PKCε)，是導(dǎo)致肥胖相關(guān)脂質(zhì)代謝紊亂的關(guān)鍵途徑，可誘導(dǎo)肝胰島素抵抗和2型糖尿病。在肝臟中DAG含量增加的物質(zhì)中，sn-1,2-DAG是唯一能直接激活肝臟中PKCε的立體異構(gòu)體。抑制sn-1,2-DAG-PKCε信號(hào)軸是治療代謝性疾病的一種很有前途的策略。
文獻(xiàn)來(lái)源
近日，中國(guó)藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李萍/楊華/鄭祖國(guó)團(tuán)隊(duì)在Cell Metabolism發(fā)表題為“Discovery of a potent allosteric activator of DGKQ that ameliorates obesity-induced insulin resistance via the sn-1,2-DAG-PKCε signaling axis”的研究性論文，該研究利用高內(nèi)涵篩選結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，篩選出中藥活性成分白術(shù)內(nèi)酯II(AT II)可降低肝臟sn-1,2-DAG水平，抑制PKCε活性，改善肥胖型胰島素抵抗，并發(fā)現(xiàn)AT II的作用靶蛋白為DGKQ，深入的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)AT II別構(gòu)激活DGKQ，且這一效應(yīng)具有物種保守性。
AT II作為一種新型的肝臟sn-1,2-DAG抑制劑，抑制PKCε活性
首先使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)探針，分別在PKCε的N端和C端使用CFP和YFP來(lái)監(jiān)測(cè)PKCε的活性。利用高內(nèi)涵技術(shù)建立PKCε抑制劑的高通量篩選體系，同時(shí)利用UPLC-TOF-MS分析，建立了一種降低細(xì)胞sn-1,2-DAG的活性化合物的篩選方法。結(jié)果表明，AT II作為一種新型的肝臟sn-1,2-DAG抑制劑，抑制 PKCε活性。
(圖1 AT II作為sn-1,2-DAG-PKCε通路抑制劑的篩選和鑒定)
AT II通過(guò)胰島素敏感的IRS1-PI3K-AKT通路抑制糖異生
為了進(jìn)一步確證AT II藥效作用，首先在細(xì)胞水平考察了AT II改善胰島素抵抗的效應(yīng)，結(jié)果顯示AT II以劑量和時(shí)間依賴(lài)性的方式上調(diào)PA介導(dǎo)磷酸化，降低了PA誘導(dǎo)的糖異生酶的基因表達(dá)和糖異生基因表達(dá)，即AT II通過(guò)胰島素敏感的IRS1-PI3K-AKT通路抑制糖異生。
(圖2 AT II通過(guò)抑制糖異生和促進(jìn)肝糖原合成來(lái)改善DIO小鼠的胰島素抵抗)
AT II改善肥胖誘導(dǎo)的高脂血癥、肝脂肪變性和胰島素抵抗
接著利用長(zhǎng)期高脂飲食(24周)、短期高脂飲食(1, 2, 4, 6周)和ob/ob小鼠誘導(dǎo)肥胖胰島素抵抗模型，分別研究AT II的藥理效力，急性毒性試驗(yàn)顯示，小鼠的行為和生命體征無(wú)明顯變化。藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明AT II主要在肝臟中富集，而不產(chǎn)生毒性。為確定AT II的潛在療效，分別給予二甲雙胍治療，同時(shí)進(jìn)行高胰島素-正血糖鉗夾研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AT II治療導(dǎo)致小鼠的肝臟、肌肉和脂肪組織的全身胰島素敏感性。與上述結(jié)果一致，AT II還降低了肝臟sn-1、2-DAG水平。為進(jìn)一步研究AT II影響能量消耗和體重的機(jī)制，使用Ucp1基因敲除小鼠進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)UCP-1的表達(dá)在脂肪組織中受到AMPK-PGC1a通路的調(diào)控，它可以促進(jìn)脂肪組織的褐變，增加能量消耗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AT II通過(guò)脂肪組織中的AMPK-PGC1a-UCP-1信號(hào)軸促進(jìn)能量消耗和降低體重。綜上結(jié)果表明AT II改善肥胖誘導(dǎo)的高脂血癥、肝脂肪變性和胰島素抵抗。
(圖3 AT II通過(guò)抑制糖異生和增加肝糖原合成，改善ob/ob或DIO小鼠的胰島素抵抗和肝脂肪變性)
AT II改善肥胖型胰島素抵抗是依賴(lài)于肝臟sn-1,2-DAG-PKCε信號(hào)軸
研究發(fā)現(xiàn)，在過(guò)表達(dá)PKCε的肝細(xì)胞中，AT II不再增加被PA損傷的胰島素敏感 AKT通路的活性，同時(shí)使用腺相關(guān)病毒(AAV)介導(dǎo)小鼠肝臟過(guò)表達(dá)PKCε，逆轉(zhuǎn)了AT II對(duì)AKT活性的影響。
綜合以上多種基因操控和藥理學(xué)手段，在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平均驗(yàn)證AT II改善肥胖型胰島素抵抗是依賴(lài)于肝臟sn-1,2-DAG-PKCε信號(hào)軸。
(圖4 外源性過(guò)表達(dá)PKCε逆轉(zhuǎn)了AT II對(duì)AT II治療后胰島素抵抗的影響)
AT II并不影響 DGKA、DGKE或DGKZ的活性，且AT II的三種衍生物對(duì)DGKQ沒(méi)有產(chǎn)生任何激活作用
為了確定AT II的潛在靶點(diǎn)并進(jìn)一步闡明抗代謝疾病作用的分子機(jī)制，設(shè)計(jì)并合成了保留AT II原活性的探針(A6)。為了探究AT II是否直接影響DGKQ的激活，文中建立了一種定量和非放射性的方法來(lái)測(cè)量DGKs的活性，發(fā)現(xiàn)AT II并不影響 DGKA、DGKE或DGKZ的活性，且AT II的三種衍生物對(duì)DGKQ沒(méi)有產(chǎn)生任何激活作用。
(圖5 DGKQ被確定為AT II的靶點(diǎn))
AT II改善肥胖型胰島素抵抗完全依賴(lài)于肝臟DGKQ
因此，利用化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)、MST、SPR、CETSA、DARTs、非放射性酶活檢測(cè)等方法，確定AT II可特異性激活二酰甘油激酶θ(DGKQ)。進(jìn)一步通過(guò)DGKQ抑制劑R59022以及DGKQ KO細(xì)胞，在細(xì)胞水平上證明了AT II通過(guò)激活DGKQ，從而抑制sn-1,2-DAG-PKCε信號(hào)軸，發(fā)揮改善胰島素抵抗作用；通過(guò)建立肝臟特異性Dgkq敲降小鼠，在動(dòng)物水平驗(yàn)證了AT II改善肥胖型胰島素抵抗完全依賴(lài)于肝臟DGKQ。
(圖6 AT II通過(guò)sn-1,2-DAG-PKCε通路對(duì)胰島素抵抗的影響依賴(lài)于DGKQ)
AT II和肝臟Dgkq之間的直接相互作用介導(dǎo)了AT II的體內(nèi)藥理活性
最后為了深入探究AT II激活DGKQ的作用機(jī)制，研究構(gòu)建了DGKQ不同結(jié)構(gòu)域的重組蛋白，通過(guò)A6探針進(jìn)行pull down實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)AT II可與DGKQ的CRD和PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合。通過(guò)同源建模、位點(diǎn)突變等，發(fā)現(xiàn)CRD結(jié)構(gòu)域中的S193、C204和S241三個(gè)氨基酸位點(diǎn)在AT II和DGKQ的結(jié)合中起著決定性作用，而PH結(jié)構(gòu)域中的A496、P497和H498三個(gè)氨基酸則可能是有助于AT II進(jìn)入藥物結(jié)合口袋。為了進(jìn)一步探索Dgkq這種新型藥物口袋在AT II體內(nèi)療效中的重要性，作者通過(guò)AAV介導(dǎo)表達(dá)Dgkq野生型或Mut6突變體，恢復(fù)了肝臟中的Dgkq水平。其結(jié)果共同支持了AT II和肝臟Dgkq之間的直接相互作用介導(dǎo)了AT II的體內(nèi)藥理活性的假說(shuō)。
(圖7 CRD結(jié)構(gòu)域的氨基酸以及PH結(jié)構(gòu)域氨基酸對(duì)AT II的結(jié)合和作用具有重要作用)
綜上所述，抑制sn-1,2- DAG-PKCε信號(hào)軸是治療代謝性疾病的一種很有前途的策略，該研究中AT II激活DGKQ，改善與肥胖相關(guān)的胰島素抵抗、脂質(zhì)積累和能量消耗，是一種很有前途的改善肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗的先導(dǎo)化合物，其研究發(fā)現(xiàn)為肥胖型胰島素抵抗的藥物研發(fā)策略提供了借鑒。
吉滿(mǎn)助力
本研究中所用相關(guān)腺相關(guān)病毒p-AAV-TBG-mPKCε-3Flag，p-AAV-TBG-GFP-MCS-3Flag，AAV8-GFP-U6-mDgk-shRNA，AAV8-GFP-U6-scrambledshRNA均由吉滿(mǎn)生物提供。 了解更多質(zhì)粒構(gòu)建,病毒包裝,穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建,敲除細(xì)胞株,報(bào)告基因檢測(cè)等相關(guān)服務(wù)。歡迎訪問(wèn)吉滿(mǎn)生物官網(wǎng)：www.news.ytakw.cn 免費(fèi)咨詢(xún)電話：400-627-9288
