文獻(xiàn)解讀
2025年2月，美國(guó)德克薩斯州達(dá)拉斯德克薩斯大學(xué)研究人員在Nature Communications上發(fā)表題為“BBOX1 restrains TBK1-mTORC1 oncogenic signaling in clear cell renal cell carcinoma”的文章。
研究發(fā)現(xiàn)γ-丁?；?β-羥基酶1（BBOX1）在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（ccRCC）中常常表達(dá)缺失，數(shù)據(jù)表明恢復(fù)BBOX1的表達(dá)可以抑制ccRCC異種移植模型中的細(xì)胞活性和腫瘤形成。機(jī)制上BBOX1通過(guò)減弱DCLK2-TBK1致癌信號(hào)通路，在生理?xiàng)l件下拮抗mTORC1和糖酵解，從而發(fā)揮其抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。
研究背景
在2022年，美國(guó)約有79,000例新發(fā)腎癌病例和13,390例死亡。透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（ccRCC）占腎癌的85%，是一種具有致命性的疾病，并且對(duì)化療經(jīng)典上具有抗藥性。
ccRCC的主要致病機(jī)制涉及von Hippel–Lindau（VHL）基因失活，導(dǎo)致HIF2α的穩(wěn)態(tài)維持，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。盡管一些HIF2α抑制劑顯示出一定的治療潛力，但仍然有相當(dāng)一部分ccRCC對(duì)其耐藥，強(qiáng)調(diào)了發(fā)掘新的治療靶點(diǎn)的重要性。
項(xiàng)目研究
研究人員首先對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中與癌癥患者結(jié)果相關(guān)的 BBOX1遺傳特征進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，BBOX1基因表達(dá)與ccRCC患者的預(yù)后顯著相關(guān)，高表達(dá)BBOX1的患者預(yù)后較好。
在ccRCC腫瘤組織中，BBOX1的mRNA和蛋白水平均顯著低于正常腎組織，且這種下調(diào)與腫瘤的分期、分級(jí)和代謝特征相關(guān)。此外，BBOX1在ccRCC細(xì)胞系中也表現(xiàn)出特異性下調(diào)，尤其是在惡性轉(zhuǎn)化的腎近曲小管細(xì)胞中。研究結(jié)果表明，BBOX1可能作為ccRCC的腫瘤抑制基因，其表達(dá)下調(diào)與ccRCC的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。
圖1 BBOX1 在 ccRCC 中顯著下調(diào)
為了研究 BBOX1 在 ccRCC 中的功能作用，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BBOX1的高表達(dá)顯著抑制了ccRCC細(xì)胞在體內(nèi)形成的腫瘤生長(zhǎng)，但在傳統(tǒng)高營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響。相反，在營(yíng)養(yǎng)限制的生理?xiàng)l件下（如低葡萄糖和/或谷氨酰胺水平），BBOX1的恢復(fù)顯著降低了細(xì)胞的存活率和錨定獨(dú)立生長(zhǎng)能力。
BBOX1 是一種具有已知晶體結(jié)構(gòu)的代謝酶，因此研究人員構(gòu)建了表達(dá)BBOX1的催化失活突變體（CD）的786-O細(xì)胞系進(jìn)行體內(nèi)異種移植實(shí)驗(yàn)，與野生型BBOX1相比，CD突變體無(wú)法抑制腫瘤生長(zhǎng)，表明BBOX1通過(guò)酶活性在營(yíng)養(yǎng)限制的生理?xiàng)l件下發(fā)揮腫瘤抑制作用。
圖2 BBOX1 重新表達(dá)抑制生理生長(zhǎng)條件下 ccRCC 腫瘤發(fā)生和細(xì)胞生長(zhǎng)
為了闡明 BBOX1 抑制 ccRCC 的分子機(jī)制，研究人員比較了BBOX1高表達(dá)的786-O細(xì)胞在體外（DMEM培養(yǎng)）和體內(nèi)（異種移植腫瘤）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析差異表達(dá)基因（DEGs）。研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)外差異表達(dá)基因之間幾乎沒(méi)有重疊，BBOX1在體內(nèi)外的作用機(jī)制可能存在顯著差異。
對(duì)體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)錄組進(jìn)一步生信分析發(fā)現(xiàn)，BBOX1的恢復(fù)顯著抑制了促進(jìn)ccRCC腫瘤發(fā)展的mTORC1信號(hào)通路活性，而這種抑制作用在傳統(tǒng)培養(yǎng)基中并未觀察到，研究人員通過(guò)RT-qPCR、免疫熒光和免疫組化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。
圖3 BBOX1 減弱 ccRCC 中的 mTORC1 信號(hào)傳導(dǎo)
ccRCC 的特征是糖酵解增強(qiáng)伴隨著線粒體呼吸抑制，葡萄糖代謝對(duì)于這種類型的惡性腫瘤尤為重要。
因此研究人員通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)和代謝分析探討B(tài)BOX1在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（ccRCC）中對(duì)糖酵解途徑的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在營(yíng)養(yǎng)限制的生理?xiàng)l件下，BBOX1恢復(fù)表達(dá)顯著下調(diào)了腫瘤和786-O細(xì)胞中糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)，并減少了糖酵解和三羧酸循環(huán)（TCA cycle）中間產(chǎn)物的積累，敲除細(xì)胞中BBOX1則促進(jìn)了糖酵解的能力，但在傳統(tǒng)高營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中這種抑制作用不明顯。
圖4 BBOX1 在生理?xiàng)l件下抑制糖酵解
為了從機(jī)制上進(jìn)一步了解 BBOX1 如何通過(guò)抑制 mTORC1 和糖酵解來(lái)控制 ccRCC 腫瘤發(fā)生，通過(guò)免疫沉淀-質(zhì)譜分析（IP-MS）發(fā)現(xiàn)，TBK1是與BBOX1相互作用的頂級(jí)候選蛋白之一，在異種移植腫瘤中存在顯著的內(nèi)源性相互作用，且這種相互作用依賴于BBOX1的酶活性。
在細(xì)胞和皮下腫瘤實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TBK1的敲低顯著抑制了由BBOX1敲除引起的mTORC1激活、糖酵解增加和細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)。TBK1是BBOX1介導(dǎo)的腫瘤抑制功能的核心介質(zhì)，其活性對(duì)于BBOX1的功能至關(guān)重要。
圖5 確定 TBK1 是 ccRCC 中促進(jìn) BBOX1 發(fā)揮作用的關(guān)鍵介質(zhì)
TBK1 已被證明在幾種癌癥模型中促進(jìn)或抑制 mTORC1，然而，目前尚不清楚 TBK1 是否調(diào)節(jié) ccRCC 中的 mTORC1 或其他促腫瘤途徑（如糖酵解）。
通過(guò)體外細(xì)胞免疫印跡和ECAR實(shí)驗(yàn)表明，TBK1的敲低顯著抑制了mTORC1信號(hào)通路的活性和糖酵解能力，而野生型TBK1或激活（S172D）突變體的過(guò)表達(dá)則顯著促進(jìn)了這些過(guò)程，但這種作用僅在營(yíng)養(yǎng)限制培養(yǎng)基中觀察到，在DMEM（高營(yíng)養(yǎng)）培養(yǎng)基中未發(fā)現(xiàn)顯著變化。
接下來(lái)進(jìn)行小鼠體內(nèi)異種移植腫瘤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示腫瘤生長(zhǎng)趨勢(shì)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，TBK1 僅在生理?xiàng)l件下促進(jìn) mTORC1和糖酵解。
圖6 生理?xiàng)l件下，TBK1 是 mTORC1 激活和糖酵解所必需的
接下來(lái)，研究者通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)和分子機(jī)制探討B(tài)BOX1如何影響ccRCC中的TBK1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BBOX1的表達(dá)與TBK1的活性呈負(fù)相關(guān)，免疫沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證BBOX1與DCLK2可以直接相互作用，并通過(guò)阻斷DCLK2-TBK1的結(jié)合來(lái)抑制TBK1的激活。這種抑制作用在營(yíng)養(yǎng)限制的生理?xiàng)l件下尤為顯著，并最終導(dǎo)致mTORC1信號(hào)通路和糖酵解途徑的抑制。
圖7 BBOX1 負(fù)向調(diào)節(jié) ccRCC 中的 TBK1 活化
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