文獻(xiàn)解讀
今年2月，南昌大學(xué)藥學(xué)院夏春華與劉方蘭團(tuán)隊(duì)在Molecular Cancer期刊上發(fā)表題為“Hsa_circ_0125356 promotes gemcitabine resistance by modulating WNT canonical and non-canonical pathways via miR-582-5p/FGF9 axis in non-small cell lung cancer”的研究論文。 該研究發(fā)現(xiàn)并鑒定了一種circRNA—hsa_circ_0125356，并進(jìn)一步探討了其在非小細(xì)胞肺癌中對(duì)吉西他濱耐藥新機(jī)制。 研究背景 非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是全球癌癥發(fā)病率和死亡率最高的類型，嚴(yán)重威脅人類健康。盡管化療顯著提高了患者的預(yù)后，耐藥性的問(wèn)題依然是制約其治療效果的主要障礙。尤其是吉西他濱（gemcitabine），作為常用的化療藥物，其耐藥性使得治療效果大打折扣。 最近的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA（circRNA）作為一種重要的非編碼RNA，可能在NSCLC的發(fā)展與化療耐藥性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過(guò)調(diào)控miRNA和與蛋白質(zhì)的相互作用，circRNA在多種癌癥的耐藥機(jī)制中扮演著重要角色，但在NSCLC中其具體作用機(jī)制尚待深入探討。 項(xiàng)目研究 首先作者構(gòu)建了吉西他濱耐藥細(xì)胞模型 （A549-GR），通過(guò)測(cè)序確定了差異表達(dá)的circRNA，鎖定了hsa_circ_0125356 在 A549-GR 細(xì)胞中比其他候選 circRNA 表達(dá)量更高，測(cè)序顯示該基因由 SLC7A11 剪接而來(lái)，通過(guò)C引物和D引物進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)不能通過(guò) gDNA 擴(kuò)增；通過(guò)FISH等發(fā)現(xiàn)其定位在細(xì)胞質(zhì)中，通過(guò)與癌旁細(xì)胞相比，發(fā)現(xiàn)癌組織中的 hsa_circ_0125356 顯著上調(diào)，說(shuō)明該基因可能參與了腫瘤進(jìn)程。 Fig.1 NSCLC 中新型吉西他濱耐藥相關(guān) circRNA 的發(fā)現(xiàn)和特征 通過(guò)對(duì)hsa_circ_0125356進(jìn)行干擾及過(guò)表達(dá)操作，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有吉西他濱處理的情況下，過(guò)表達(dá)或干擾circ_0125356幾乎不影響 A549 和 A549-GR 細(xì)胞的增殖和遷移能力；但是在有吉西他濱的存在下，hsa_circ_0125356干擾顯著抑制了 A549-GR 細(xì)胞的活力； 隨后通過(guò)凋亡，集落形成等實(shí)驗(yàn)，證明hsa_circ_0125356促進(jìn)了吉西他濱治療后 NSCLC 細(xì)胞的增殖、遷移和耐藥。 Fig.2 CircRNA-0125356 促進(jìn) NSCLC 細(xì)胞對(duì)吉西他濱的耐藥性 進(jìn)一步數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，找到與circ_0125356可能存在調(diào)控的miRNA，通過(guò)對(duì)miRNA進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-582-5p與circ_0125356成負(fù)相關(guān)，并且通過(guò)FISH發(fā)現(xiàn)二者共定位在細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)一步通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證明hsa_circ_0125356 充當(dāng) miR-582-5p 的 miRNA 海綿，并負(fù)向調(diào)節(jié) A549 和 A549-GR 細(xì)胞中的 miR-582-5p。
Fig.3 Hsa_circ_0125356 代表一種有效的 miR-582-5p miRNA 海綿
緊接著，作者又進(jìn)一步研究了 miR-582-5p 對(duì) NSCLC 細(xì)胞吉西他濱耐藥的生物學(xué)功能，通過(guò)miR-582-5p 模擬物處理，增強(qiáng)了 A549 細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性，轉(zhuǎn)染 hsa_circ_0125356 質(zhì)粒后效果相反，通過(guò)一系列功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證不同處理后對(duì)吉西他濱的敏感性，表明hsa_circ_0125356 通過(guò)海綿 miR-582-5p 促進(jìn) NSCLC 進(jìn)展和吉西他濱耐藥，最終導(dǎo)致其致癌作用。
Fig.4 Hsa_circ_0125356 通過(guò) miR-582-5p 調(diào)節(jié) NSCLC 細(xì)胞的腫瘤進(jìn)展和吉西他濱耐藥
以上研究了circRNA與miRNA的調(diào)控，后半部分作者研究的是miRNA的靶基因的情況，通過(guò)預(yù)測(cè)及報(bào)告基因等實(shí)驗(yàn)確定了FGF9為 miR-582-5p的下游靶基因。
Fig.5 FGF9 被鑒定為 miR-582-5p 的功能靶基因，可增強(qiáng) NSCLC 細(xì)胞的吉西他濱耐藥性
為了研究上述機(jī)制和吉西他濱耐藥性的關(guān)系，作者對(duì)吉西他濱耐藥細(xì)胞模型進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序發(fā)現(xiàn)FGF9 在 A549-GR 細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于 A549 細(xì)胞，通過(guò)對(duì)FGF9過(guò)表達(dá)/干擾發(fā)現(xiàn)在吉西他濱暴露下，A549-GR 細(xì)胞敲低 FGF9 后 IC 50 值顯著降低，表明 FGF9 敲低促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)吉西他濱更敏感。
接下來(lái)通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行損傷處理，驗(yàn)證吉西他濱敏感程度與FGF9 的關(guān)系，研究表明hsa_circ_0125356 通過(guò)海綿 miR-582-5p/FGF9 通路促進(jìn)吉西他濱耐藥。
Fig.6 Hsa_circ_0125356 通過(guò) miR-582-5p/FGF9 軸維持吉西他濱耐藥性
據(jù)研究顯示，FGF9 通過(guò)調(diào)節(jié) WNT 和絲裂原活化蛋白激酶 （MAPK） 信號(hào)通路與腫瘤進(jìn)展和耐藥性相關(guān)。
因此作者結(jié)合這一情況，對(duì)FGF9在A549-GR 細(xì)胞中是否也是相同的作用情況展開(kāi)研究，F(xiàn)GF9 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了吉西他濱處理后吉西他濱耐藥 A549-GR 細(xì)胞中經(jīng)典 WNT 通路相關(guān)蛋白、非經(jīng)典 WNT 通路相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的變化等，隨后作者使用WNT 通路抑制劑，發(fā)現(xiàn)抑制劑在吉西他濱處理后消除了 IC50 值的變化，并形成了由hsa_circ_0125356過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的菌落，這些結(jié)果共同表明hsa_circ_0125356通過(guò) WNT 經(jīng)典和非經(jīng)典信號(hào)通路調(diào)節(jié) FGF9 的表達(dá)以維持吉西他濱耐藥。
Fig.7 FGF9 通過(guò)經(jīng)典和非經(jīng)典 WNT 信號(hào)通路增強(qiáng)吉西他濱耐藥性
作者通過(guò)構(gòu)建小鼠模型，對(duì)以上細(xì)胞機(jī)制開(kāi)展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證 hsa_circ_0125356 對(duì)體內(nèi)吉西他濱耐藥性的影響，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0125356通過(guò)體內(nèi) WNT 經(jīng)典和非經(jīng)典信號(hào)通路調(diào)節(jié) miR-582-5p/FGF9 軸以增強(qiáng) NSCLC 中的吉西他濱耐藥性。
Fig.8 Hsa_circ_0125356 通過(guò) WNT 經(jīng)典和非經(jīng)典信號(hào)通路促進(jìn) NSCLC 中的吉西他濱耐藥
研究結(jié)論
綜上所述，研究首次證明hsa_circ_0125356為非小細(xì)胞肺癌中吉西他濱耐藥的生物標(biāo)志物，通過(guò)吸附miR-582-5p/FGF9軸調(diào)控WNT經(jīng)典和非經(jīng)典信號(hào)通路，為識(shí)別治療非小細(xì)胞肺癌吉西他濱耐藥的靶點(diǎn)提供了新的方向。
Hsa_circ_0125356 通過(guò) WNT 經(jīng)典和非經(jīng)典信號(hào)通路促進(jìn) NSCLC 中的吉西他濱耐藥
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