背景介紹
RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指一種分子生物學上由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機制是通過阻礙特定基因的轉錄或翻譯來抑制基因表達。
由于RNAi具有高度的序列專一性，可以特異地沉默基因，從而獲得基因功能喪失或基因表達量的降低。
（圖片來源：RNA Therapeutics Institute）
上篇為大家介紹了siRNA、shRNA兩種常用的基因干擾工具，詳情可點擊基因干擾研究工具（上）查看，今天就繼續(xù)為大家介紹基因干擾相關的特色服務，一起往下看吧~
組織特異性干擾: miR30-shRNA
表達shRNA常用的polⅢ型啟動子有U6和H1，由于構建序列較短，shRNA能夠輕易的插入病毒載體，但是想實現(xiàn)特定組織中的基因沉默，少不了組織特異性啟動子的助力，然而U6和H1并不具有組織特異性。
基于miRNA骨架的shRNA干擾載體，采用了pol II型啟動子(包括多種組織特異性啟動子)驅(qū)動，從而實現(xiàn)特定組織中的基因沉默。目前用于干擾作用的miRNA骨架(如miR30、miR155、miR17-92等)中，最常用的就是miR30結構。
載體優(yōu)勢
一、啟動子選擇性多
基于mir30的shRNA可以通過RNA聚合酶II啟動子轉錄，包括CMV、CAG、誘導型啟動子和組織特異性啟動子等，尤其是組織特異性啟動子，在這類啟動子的作用下，利用miR30結構實現(xiàn)的基因敲低往往只限于某些特定的組織或器官，同時表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)等特性。
二、多個shRNA共表達
RNA聚合酶II能夠有效轉錄長RNA，因此可以通過多順反子結構將多個shRNA構建至同一個啟動子下，縮減載體長度的同時可以實現(xiàn)對多個基因的RNA干擾。
三、報告基因共表達
通過多順反子結構將shRNA與報告基因在同一啟動子下表達，能更精確地監(jiān)測shRNA的轉錄水平。
四、作用穩(wěn)定且高效
基于miR30結構的shRNA不太容易通過干擾內(nèi)源性miRNA途徑引起細胞毒性；miR30的天然環(huán)狀結構能確保精確的Dicer切割并減少脫靶效應。
吉滿生物可以為客戶提供多種特異性啟動子，能夠?qū)崿F(xiàn)不同組織/細胞的特異性表達?？梢詫⑦x定啟動子和shRNA序列構建至mir30-shRNA載體上，并能提供序列篩選服務，助力篩選出干擾效果更好的shRNA(mir-30)，此外，我們還可進行后續(xù)慢病毒（點擊了解產(chǎn)品）、腺相關病毒（點擊了解產(chǎn)品）的包裝，實現(xiàn)組織特異性基因沉默！
Tet-On誘導性干擾
Tet調(diào)控表達系統(tǒng)通過誘導藥物(如四環(huán)素和強力霉素等)改變調(diào)控蛋白的構象，從而達到調(diào)控目標蛋白表達的目的。TetR(Tet阻遏蛋白,Tet repressor protein)與TetO(Tet操縱子,Tet operator)，能夠特異性結合。
當無誘導藥物存在時，TetR會與TetO結合，從而阻斷下游耐藥基因的表達；當有誘導藥物存在時，TetR的構象會發(fā)生改變，并從TetO上脫離下來，使下游耐藥基因得以表達。
Tet-on系統(tǒng)組成
調(diào)節(jié)表達載體 | 反應表達載體 |
PhCMV（人巨細胞病毒早期啟動子） | TRE（Tet應答元件，Tet-responsive element） |
rtTA(反義Tet轉錄活化因子，reverse tetracycline transcriptional activator)：rTetR(反義TetR，reverse TetR）和單純皰疹病毒（HSV)VP16 蛋白C端的一段轉錄激活區(qū)域融合而成。 | PminCMV（CMV啟動子，minimal CMV promoter） |
目的基因組成 |
Tet-on原理
rtTA是由tTA突變4個氨基酸形成，它的表型與tTA相反。生理條件下，rtTA與TRE不結合，由于PminCMV缺少增強子，因此目的基因不表達；
給于DOX后，DOX與rtTA的結合體與TRE結合，從而啟動基因表達。
吉滿生物為客戶提供tet-on干擾慢病毒包裝以及細胞株構建服務。
CRISPRi（基因抑制/沉默）
CRISPRi(CRISPR Interference)系統(tǒng)是在CRISPR/Cas9 的基礎上發(fā)展而來的，可特異性地抑制靶基因的轉錄而并非將基因knockout來實現(xiàn)調(diào)控。相比于knockout，CRISPRi 能夠在不同水平對靶基因進行劑量控制的敲減，是用于抑制內(nèi)源性基因轉錄的強大工具。
當dCas9(沒有切割活性的Cas9)被引導到靶基因的轉錄起始位點TSS(transcription start site)時，dCas9能夠物理性阻礙RNA聚合酶的通過，導致基因沉默。同時dCas9融合了一個基因抑制結構域，如KRAB結構域，這樣的蛋白稱之為dCas9-KRAB，可以進一步提高轉錄抑制的效率。此外，dCas9也可以融合雙抑制結構域KRAB-MeCP2，抑制效果更佳。
由于dCas9-KRAB CRISPRi系統(tǒng)是在DNA水平抑制基因表達，因此適用于多種類型的基因，包括：mRNA、非編碼RNA、反義轉錄本、核定位RNA以及聚合酶III 轉錄本等基因的轉錄抑制等。
技術優(yōu)勢
不改變內(nèi)源基因組背景、介導的敲低是可誘導且可逆、基因抑制效果可篩選、適用更多基因種類。
服務流程
